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本试剂盒采用的内毒素清除剂，经过3次处理可去除99%的内毒素，DNA损失小于20%，从根本上避免了内毒素对后续实验的影响。此外，本试剂盒采用了一种新型的吸附材料，新吸附柱拥有良好的流速、超强的DNA结合能力和优秀的洗脱效率。改良的配方使试剂盒的菌液裂解能力、DNA与吸附柱的结合能力大大加强，新型裂解染料Visualysis的加入让裂解过程变得可视、可控，实现质粒得率最大化。操作过程快速、方便，无需使用酚/氯仿抽提，无需乙醇沉淀，整个抽提过程大约需要2个小时。

本试剂盒抽提得到的质粒纯度高，OD₂₆₀/OD₂₈₀比值一般为1.8～1.9之间，OD₂₆₀/OD₂₃₀比值大于2.0，可直接用于转化、DNA测序、PCR、基于PCR的突变、体外转录、酶切等后续实验。

• 试剂盒于常温运输，未开启的试剂盒可以于室温保存，有效期见包装。加入RNase A后，Buffer P1请存放于2～8℃，有效期为半年。Buffer EBG长期保存请置于4℃。
  
• Buffer MP3和Buffer DW1中含有刺激性的化合物，操作过程中应穿上实验服，戴好乳胶手套，避免沾染皮肤、眼睛和衣服，防止吸入口鼻。沾染皮肤或眼睛后，请立即用清水或生理盐水冲洗，必要时寻求医生的帮助。

• 自备材料：小型高速离心机(最大离心力≥12000×g)、水浴锅、1.5mL Endotoxin-Free离心管、无水乙醇等。实验自备的试剂与耗材应无外源性内毒素污染。
  
• 试剂盒初次开启，将RNase A全部加入Buffer P1中，混匀后在瓶身做好标记。储存于2～8℃，有效期为6个月。
  
• 按瓶身标签说明在Wash Solution中加入相应量的无水乙醇(乙醇终浓度为80%)，混匀后在瓶身做好标记。于室温密封保存。
  
• 每次使用前请检查Buffer P2是否出现沉淀，如有沉淀，请于37℃溶解沉淀，待冷却至室温后使用。
  
• 准备水浴锅调节温度至65℃。
  
• 将Buffer EBG置于冰上预冷。

• 在含合适抗生素的培养基中接种目标菌株，于37℃摇床充分振荡培养12～16h。
  
  • 菌液状态对质粒得率非常关键，请用不超过容器容量1/4体积的培养基进行培养。
    
  • 处于生长平台期的菌体用于质粒抽提得率最高，过度培养可能导致DNA降解。
• 对于高拷贝质粒，取1.5～3mL菌液，于室温4000rpm离心1min，弃上清。
  
  • 如果取3mL菌液可分两次收集菌体，用移液器小心吸去上清，以免沉淀丢失。
• 在菌体沉淀中加入250μL Buffer P1，吸打或振荡至彻底悬浮菌体
  
  • Buffer P1首次使用时请检查是否已加入RNase A。
    
  • 一定要彻底悬浮菌体，否则影响得率和质量。
    
  • 如果使用Visualysis，则在加入250μL Buffer P1后再加入1μL Visualysis，振荡混匀。
    
  • Visualysis需在临用前加入，直接加入到Buffer P1中出现浑浊为正常现象。
• 加入250μL Buffer P2，立即温和颠倒离心管5～10次混匀，室温静置2～4min。
  
  • 裂解时间与菌量相关，菌量多则适当延长时间，最长不能超过5分钟。
    
  • 质粒中量、大量提取混匀时一定要温和以免质粒DNA断裂。
    
  • 如果同时操作多个样品，每加入一管混匀一管，不要采用全部加入一起混匀的方法，计时从第一管样品加入开始。
    
  • 如果使用了Visualysis，则溶液呈现均匀的蓝色表示混匀良好，如果出现白色团块，则提示菌体可能过量，宜选用更少的菌液重新开始。
• 加入125μL Buffer MP3，立即温和颠倒离心管5～10次充分混匀。
  
  • 如果同时操作多个样品，每加入一管混匀一管，不宜采用全部加入一起混匀的方法。
    
  • 加入Buffer MP3后，离心管中会立即出现大量白色絮状沉淀，如果使用了Visualysis，则溶液由蓝色重新变为无色，有蓝色残留表示混匀不彻底，继续混合至蓝色全部消失。
    
  • 如果起始菌液较多，混匀后室温静置2分钟以彻底去除RNA。
• 于离心机12000g室温离心10min，转移上清至一新的1.5mL离心管中，上清体积大约为500～550μL。
  
• 加入0.1倍的Buffer EBG至上清中，颠倒混匀。
  
  • 如果上清为500μL，则加入50μL Buffer EBG。
• 冰浴10min，期间颠倒混匀3～5次。
  
  • 加入Buffer EBG后溶液变浑浊，冰浴后溶液变澄清。
• 65℃水浴直到溶液变浊或出现分层为止(一般需要1～5min)
  
• 于离心机12000g室温离心3min，转移无色透明的上层水相至一干净的1.5mL离心管中。
  
  • 不能低温离心，离心后上层为无色透明，下层为淡蓝色。
    
  • 使用Buffer EBG处理一次大概可以去除质粒上清当中90%的内毒素。、
    
  • 如对内毒素含量有更高要求，可以重复步骤7～10，使用Buffer EBG处理三次可以去除99%以上的内毒素，但是质粒也会损失20%左右。
• 加入0.5倍体积的无水乙醇，上下颠倒混匀6～7次，室温放置2分钟。
  
• 将上述混匀的溶液全部小心移入吸附柱，9000×g离心30sec。倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中。
  
  • 吸附柱的最大有效容积为750μL，如果溶液较多，可以重复该步骤直至所有溶液流过吸附柱。
• (可选步骤)在吸附柱中加入500μL去蛋白液Buffer DW1，9000g离心30sec。倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中。
  
  • 对于End A+宿主菌，如BL21，HB101，JM系列等，此步不能省略。
    
  • 对于End A-宿主菌，如DH5α，TOP10等，此步可以省略，但进行该步骤将进一步降低蛋白残留量。
• 向吸附柱中加入500μL Wash Solution，9000g离心30sec。倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中。
  
  • Wash Solution首次使用前请检查是否已加入正确量的无水乙醇。
• 重复步骤14一次。
  
• 将空吸附柱和收集管放入离心机，9000g离心1min。
  
  • 此步绝不可省略，否则残余的乙醇会严重影响得率和后续实验。
• 将吸附柱放入一干净的1.5mL离心管中，开盖室温放置2～3min。
  
• 在吸附膜中央加入50～100μL Elution Buffer，室温静置1～2min，9000g离心1min。将所得到的质粒DNA溶液置于-20℃保存或用于后续试验。
  
  • Elution Buffer为2.5mM Tris-HCl，pH8.5，可以用无内毒素水(pH＞7.0)代替。将Elution Buffer预热至60℃可以进一步提高得率。
    
  • 如果质粒＞8kb，加入Elution Buffer后，在37～60℃温浴2分钟可以显著提高得率。
    
  • 质粒小量抽提时，使用小于40μL的洗脱液可以得到浓度更高的DNA，但得率显著降低。